在脊椎動物胚胎發育過程中，次級造血(definitive hematopoiesis)過程可以產生造血干祖細胞(hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC),而HSPC具有產生所有譜系的血細胞和維持機體終生血液系統的能力。在次級造血時期，哺乳動物主動脈-性腺-中腎區或斑馬魚背主動脈腹側壁區域中的一部分內皮細胞接受細胞內、外信號，獲得造血潛能，成為生血內皮細胞。這些生血內皮細胞逐漸改變自身形態，由扁平變為球形，并從背主動脈脫離出來最終轉變為HSPC。但是，這些內皮細胞如何被精確調控以進行內皮-造血的命運轉變仍未完全探究清楚。 

　　近日，中國科學院北京基因組研究所（國家生物信息中心）楊運桂研究組和中國科學院動物研究所劉峰研究組合作在PNAS雜志上發表了題為 “Cpeb1b-mediated cytoplasmic polyadenylation of shha mRNA modulates zebrafish definitive hematopoiesis” 的研究論文，揭示了胞質多聚腺苷酸化調控斑馬魚HSPC發育的機制。 

　　研究團隊發現，斑馬魚胚胎發育過程中cpeb1b在脊索區域高表達，雙熒光原位雜交顯示其與脊索特異性表達基因shha具有共定位。隨后一系列表型分析實驗顯示Cpeb1b缺失導致次級造血過程中HSPC的產生減少，并且HSPC減少是由生血內皮細胞特化缺陷導致。為了進一步研究Cpeb1b的造血調控機制，團隊收集了不同發育時期的野生型和cpeb1b突變體胚胎進行RNA-seq分析。GO (gene ontology)分析顯示，在Cpeb1b缺陷胚胎中，已知參與HSPC發育調控的關鍵信號通路Hedgehog發生了下調。結合后續生化分析，證實了Cpeb1b缺陷導致Hedgehog通路活性抑制，并進一步導致Hedgehog-Vegf-Notch 信號軸下調，最終造成HSPC的產生減少。 

　　團隊進一步通過組學及生化實驗研究該表型的分子機制。RNA immunoprecipitation (RIP)-seq和RIP-qPCR實驗結果顯示，Cpeb1b結合Hedgehog通路關鍵配體shha的mRNA。序列分析顯示，shha mRNA的3' UTR含有經典的CPE motif。通過凝膠電泳阻滯試驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)及體外/體內的CPE motif探針pull-down實驗發現，Cpeb1b能結合野生型CPE motif探針而非motif序列突變的探針，證明了Cpeb1b與shha mRNA的特異性相互作用依賴于CPE motif。 

　　通過觀察熒光標記的Cpeb1b、shha mRNA和非典型poly(A)聚合酶Tent2亞細胞定位發現，這些分子共同形成胞質內的凝聚物，并且不同凝聚物可以發生融合。光漂白恢復(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)實驗顯示，這些凝聚物中的分子可以擴散并與周圍的溶液進行交換，進一步證明了凝聚物的類液體特性，團隊因此推測此凝聚物由液-液相分離(liquid-liquid phase separation, LLPS)產生。后續分析發現，雖然Cpeb1b自身無法發生相分離，但此凝聚物中含有能發生相分離的Pabpc1b蛋白，Cpeb1b可以通過促進Pabpc1b蛋白相分離來形成大量凝聚物。然而，此凝聚現象的具體作用和詳細分子機制還有待進一步闡明。 

　　團隊提取了細胞質RNA作為材料并通過PAT (PCR poly(A) test)實驗探究Cpeb1b是否調控早期發育過程中胞質內shha mRNA的多聚腺苷酸化。結果顯示與野生型相比，cpeb1b突變體中shha mRNA的poly(A)長度明顯更短；作為對照的非Cpeb1b靶標rps18 mRNA的poly(A)長度在野生型和突變體組之間沒有差異。由此證明，Cpeb1b參與調控shha mRNA的胞質多聚腺苷酸化。通過核糖體圖譜分析(ribosome profiling)發現，與野生型相比，cpeb1b突變體中shha mRNA的翻譯效率更低。蛋白印跡分析顯示cpeb1b突變體中Shha蛋白水平也出現下降。因此，Cpeb1b通過多聚腺苷酸化來調控shha mRNA的翻譯效率。 

　　綜上所述，該研究發現在斑馬魚早期胚胎發育過程中，Cpeb1b介導的shha mRNA胞質多聚腺苷酸化能增強其翻譯效率，從而提高Shha蛋白水平。Shha蛋白通過激活Hedgehog-Vegf-Notch信號軸來促進生血內皮細胞的特化，進而維持正常的HSPC產生過程。這些發現為解析信號通路如何被精確調控并指導內皮細胞進行內皮-造血的命運轉變提供新的線索。 

　　該研究得到了基金委，科技部和中科院先導等項目資助。 

Cpeb1b介導的shha mRNA胞質多聚腺苷酸化調控斑馬魚HSPC發育的機制示意圖

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